Gene DNA

1984sus 미국 Cetus사의 Mullis가 PCR(Polymerase Chain Reaction)법 (Process for amplifying nucleic acid sequences)이라는 시험관내에서 유전자를 증폭시키는 방법을 개발하였다. 세포의 DNA가 복제될 때는 DNA를 구성하는 이중나선의 사슬의 한 가닥씩으로 나뉘어, 각각의 사슬을 주형으로 하여 쌍이 되는 DNA 복제를 인공적으로 반복하는 방법이다. Mullis는 어떤 DNA의 특정부위의 상보적인 서열을 합성해 만든 primer와 원래의 주형(template) DNA를 넣은 뒤 적정 조건에서 DNA polymerase를 넣어주고 합성을 하였다. 그 뒤 온도를 올려 합성된 이중나선을 단일나선(single strand)으로 풀고 다시 primer와 DNA polymerase를 첨가하는 반응을 되풀이하여 DNA를 2배씩 증폭시켰다.

   

1984년 초병이부위(hypervariable region)유전자가 고유한 크기를 질환 유전자 찾기, 친자관계확인, 피의자의 진범확인 등 유전자 감식에 이용할 수 있게 되었다. 이런 유전자 다형은 염기배열의 차이뿐만 아니라 반복배열수의 차이에 의한 다형도 있다. 예를 들어 ATGG ATGGATGG와 같이, 같은 염기배열이 반복되어 나타나는 부분이 많이 있는데, 이 반복 횟수가 개인에 따라 다르다. 이러한 다형은 현장에 남겨진 혈액 등에서 이 부분을 PCR법으로 대량 복사하여, 젤 전기영동(gel electrophoresis)을 시키면 바코드 모양의 DNA Finger-printing이 생기므로 이 DNA 염기배열을 비교하는 것이다.

   

1986년에는 Hunkapiller 등이 제안한 유전자의 염기 배열 결정법(Real time scanning electrophoresis apparatus for DNA sequencing)이 1987년에는 Gelfand 등이 온천에 사는 미생물에서 정제된 열안정 효소 Tag(Thermus aquaticus) polymerase를 발견(Purified thermostable enzyme)하였다. 원래 PCR법에 사용되었던 polymerase는 E. coli의 DNA polymerase I 이었는데 이 효소는 DNA를 단일나선으로 풀기 위해 온도를 올리면 파괴가 되므로 매번 효소를 다시 넣어 주어야 했었다. 이 Tag polymerase로 PCR법은 크게 향상되었다. 유전체 해독이나 유전자 진단, DNA감정을 할 때에는 극히 적은 시료를 많이 복제할 필요가 있는데, PCR 장치를 사용하면 이론적으로는 DNA를 한 시간에 수천만 배로 늘릴 수 있게 되었다.

   

Craig Venter와 Perkin Elmer(DNA 자동 분석기기 메이커) => Celera Genomics사….

   

HGP

• 인간의 몸은 혈액, 근육, 뼈, 그리고 기관 등 100조개의 세포가 특화된 것으로 각 세포에는 길이 2m의 DNA가 들어있어 사람의 몸에 있는 모든 DNA를 한 줄로 연결한다면 지구와 태양 사이를 600번 왕복할 수 있었다. 인간 몸에 있는 각 세포의 유전자 DNA는 31억개의 염기 쌍 문자(암호) A, T, C, G 로 되어 있었다. 그리고 염기쌍의 99.99%는 같고 31억개 중 2백 10만개만이 개인차가 있었다. 이것을 근거로 질병의 유전자를 찾아내며, 약의 효과 여부를 확인할 수 있고, 부작용이 심한 사람을 찾아낼 수도 있을 것이다.
• 몸에 필요한 단백질의 주형으로 되는 유전자는 수백 혹은 수천 염기쌍이 특수하게 배열된 것으로 인간유전체 중 1.5%만이 유전자이고 나머지 98.5%는 유전자의 기능과 관계가 없는 junk DNA 였다. Junk DNA중에는 DNA의 정보가 mRNA에 복사될 때 버려지는 intron이 있으며 같은 명기배열이 반복된 반복배열이 있다.
• 인간의 유전자는 벼의 유전자보다 적고 쥐나 벌레와 파리보다 조금 더 많은 3만개의 유전자로 되어있었다. 따라서 단세포 생물에서 벌레와 파리같은 작은 동물을 거쳐 사람에 이르는 복잡한 사다리를 올라감에 따라 더해지는 것은 조절 유전자 정도였다. 하나의 염기가 변화하는 데는 일정한 시간이 걸린다. 단백질을 만드는 유전자의 염기 배열의 차이를 조사하면 종이 언제쯤 분화했는지 알 수 있다. 이러한 분자시계로 계산하면 인간의 기원은 약 20만년 전으로 거슬러 올라간다. 또 하나의 유전체를 다른 유전체와 비교하고 컴퓨터와 실험으로 그들 사이의 관계를 알 수 있다. 즉 유전자 염기배열의 변화를 조사하면 각각의 생물이 언제 나뉘어져 다른 종이 되었는지 알 수 있다. 심지어 침팬지와 인간의 차이보다, 인간과 인간의 차이가 더 큰 경우도 있다.

     

  염기서열 결정방법

  인간유전체 서열 결정방법으로는 2가지 접근방식이 있다.

  하나는 인공효모염색체(YAC)에 의한 클론지도와 코스미드(Cosmid)에 의한 보다 짧은 클론지도를 작성하여 염기서열을 결정하는 것이다. 이 경우, 유전자로 암호화되어 있지 않은 대량의 의미불명의 junk 움 영역 배열도 함께 결정된다. 또 하나의 유전자가 발현하는 DNA영역 (EST: Expressed Sequence Tag) 만을 mRNA로부터 cDNA(상보적움)를 역전사하여 그 배열을 결정하는 것이다. 역전사 효소를 사용하여 일단 한 가닥 사슬의 cDNA를 합성해 버리면, 이것을 주형으로 하여 두 가닥 사슬의 cDNA를 합성해 버리면, 이것을 주형으로 하여 두 가닥 사슬의 cDNA를 합성해 버리면, 이것을 주형으로 하여 두 가닥 사슬의 cDNA를 만들어 낼 수가 있다. cDNA는 이렇게 인공적으로 만들어진 DNA이며 자연계에는 없다.

     

  DNA염기서열을 안다는 것은 4종류의 염기가 어떤 순서로 나열되어 있는지를 밝히는 것이다. 서열결정을 하는 작업을 단계별로 나누면 다음과 같다. 첫째 DNA를 잘게 자른다. DNA의 거대한 서열을 특수한 효소를 이용하여 다루기 쉽게 자른다. 둘째 클로닝을 한다. 잘라진 DNA 조각들을 수백만 개로 증폭하기 위하여 박테리아와 효모에 주입한다. 셋째 꼬리표 tagging 를 단다. 클론(clone)된 A, T, G, 또는 C로 끝나는 조각들에 발광하는 특수 용액에 나누어 붙인다. 넷째 분리separating를 한다. 이 꼬리표가 붙은 조각들은 얇은 겔로 채워진 튜브로 옮긴다. 4개의 반응물을 한 세트로 하여 나란히 전기영동을 하면 크기별로 분리가 된다. 펄스장 겔 전기영동법은 주기적으로 전기장의 방향을 바꿔어, 1천만 염기 쌍까지 분리할 수 있으므로 수백만 염기 쌍단위로 지도를 작성할 수 있다. 다섯째 해독(reading)을 한다. 염기가 하나씩 많아지는 크기대로 모든 조각들을 늘어 세우고 각 조각들의 끝에 있는 형광 꼬리표를 레이저로 읽음으로서 DNA 유전자 서열을 결정한다.

  위의 과정은 모두 자동화가 가능하다. 전기영동, 데이터 수집, 염기서열 읽기를 모두 자동화한 염기서열 결정기가 나온 것이다. 또 질량분석기를 이용한 방법도 있다. 겔 전기영동에서 사용하는 4가지 형광물질 대신 서로 다른 질량을 가지는 4가지 화합물을 질량분석기로 분석하는 것이다. 주사 전자현미경(STM)을 사용하는 방법도 있다. DNA의 이중나선 구조와 염기 쌍을 직접 볼 수 있다.

     

  DNA칩

  유전체를 이용한 신약개발과 더불어 중요한 분야는 DNA칩이다. DNA칩은 반도체칩이 기판 위에 집적 회로를 올려놓은 것과 같이, 작은 유리판 위에 염기배열이 밝혀진 수만 개의 DNA를 고밀도로 늘어놓은 것이다. DNA는 2줄의 염기사슬로 이루어져 있다. 미리 알고 있는 유전자 DNA를 칩 위에 1줄로 늘어놓고, 다른 DNA표본에 표지를 하여 반응시킨다. DNA는 이중나선구조로 되어 있는데, 그것을 풀어서 한 가닥으로 하여 미리 염기배열이 밝혀진 DNA가 있는 칩에 놓으면, 염기배열을 간단하게 알 수 있다. 염기배열을 조사하고자 하는 조각에 형광색소로 표지를 한 후 칩에 올려놓으면 대응하는 칩 위의 DNA조각과 결합한다. 칩 위의 조각은 염기배열이 밝혀진 상태이므로 표지를 한 DNA조각의 염기 배열을 해석할 수 있다. DNA칩은 현재 SNP를 찾아내거나 SNP를 판정할 때 많이 이용하고 있다.

  DNA칩 기술은 유전체의 기능 해석이나 유전 정보를 이용한 질병의 진단, 신약 개발에 없어서는 안 될 기초 기술이다. DNA칩은 2.5X7.5cm 크기의 유리판에 수만 개의 DNA 조각을 늘어놓고 있다. DNA칩은 붙이는 유전물질 크기에 따라 최소한 500염기 쌍 이상의 유전자(full-length open leading frame 또는 EST)가 붙여져 있는 cDNA칩과 약 15-25ro의 염기로 이루어진 oligonucleotide가 붙여져 있는 oligonucleotide칩으로 나눌 수 있다.

  DNA칩은 대량생산이 가능하므로, 유전자해석이나 유전자검사가 신속할 뿐 아니라 낮은 비용으로도 가능하여 유전자검사나 유전자해석에 널리 이용되고 있으며 병원 등에서는 일상적으로 질환 관련 유전자의 유무나 부작용에 대한 시험을 할 것이다. 또 정상인 조직과 암 조직 유전자의 차이, 약을 투여하기 전과 투여한 뒤의 유전자 발현의 차이 등을 집중적으로 조사할 수 있다.

     

  암에서 일어나는 유전자 발현변화를 DNA칩으로 분석하는 과정을 보자. 먼저 암세포와 정상세포에서 발현된 각각의 유전자 성분을 서로 다른 색깔의 형광물질로 구분해 표지하고 이를 합쳐서 DNA칩 상에 있는 유전자에 결합시킨다. 이 과정에서 암세포와 정상세포에서 발현된 각각의 유전자 성분들은 서로 경쟁한다. 이들의 상대적인 양의 차이는 레이저를 이용한 자동측정장치에 의해 컴퓨터에 기록되는데, 붉은색, 초록색 또는 노란색 등 육안으로도 확인이 된다. 그리고 DNA에 수록된 모든 유전자에 대해서 암세포와 정상세포의 상대적인 성분비가 계산돼 통계적인 방법으로 분석한다.

  이 결과를 통해 암세포에서 어떤 유전자들의 발현이 얼마만큼 변화했는지, 어떤 암환자들의 세포가 서로 유사한 유전자 발현패턴을 보이는지, 두 가지 이상의 암세포에서 어떤 유전자들이 공통적인 발현패턴을 보이는지 등을 신속, 정확하게 파악할 수 있다. DNA칩은 정상인의 암 발병 가능성 예측을 위한 유전자형 분석, 항암제의 안전성과 독성연구 등에서 없어서는 안될 방법이다.

     

  DNA 전사

  생명 과학의 기본은 DNA 정보에 기초를 둔 단백질을 만드는 것이다. 각각의 단백질을 작용을 해석하지 못하면 그것이 어떻게 생명활동에 관여하는지 알 수 없다. DNA의 정보를 아는 것만으로도 생명에 대한 모든 수수께끼를 밝혀 내가가 어렵다. 생명체가 단백질을 만들 때에는, 우선 DNA의 정보를 아는 것만으로는 생명에 대한 모든 수수께끼를 밝혀 내기가 어렵다. 생명체가 단백질을 만들 때에는, 우선 DNA의 이중나선이 핵 내에서 두 가닥으로 나뉘어진 상태가 된다. 효소의 작용에 따라 그 중의 한 가닥에 DNA의 염기에 대응한 RNA염기가 붙어서, mRNA에 전사된다. 인간을 비롯한 고등동물의 경우 유전자 부분은 아주 조금이다. 막 전사된 mRNA에서 단백질로 번역되는 부분(exon)과 번역되지 않는 무의미한 부분(intron)이 포함되어 있어 단백질 합성에 관계된 유전자들만을 연결하는 splicing 현상이 일어난다.

     

  mRNA는 3염기 배열(codon)이 하나의 아미노산을 지정한다. 예를 들면 adenine이 3개 늘어선 AAA는 phenylalanine 이라는 아미노산, TAC는 methionine이다. 4종의 염기에서 3종류의 배열을 선택하는 조합은 64(4의 3승)rofh 우리 몸 안에 있는 20종류의 아미노산을 지정하기에는 충분하므로 여러 개의 codon이 같은 아미노산을 지정하고 있는 경우도 있다. 예를 들면 GCU, GCA, GCG는 모두 다 alanine이라는 아미노산을 지정하고 있다. 또 막 전사된 mRNA에는 intron과 exon이 있기 때문에, 개시 codon AUG와 3개의 종지 codon UAG, UAA, UGA가 있다. AUG는 methionine은 잘라져 나간다. DNA에는 이 이외에도 mRNA를 조절하는 promoter나 전사의 효율을 증가시키는 enhancer라는 염기배열도 있다.

  세포에는 단백질을 만드는 과정은 세 단계로 나누어 설명할 수 있다. 먼저 필요한 부분만을 전사한 mRNA가 핵 밖으로 나와 세포질에 있는 단백질 합성 공장인 리보솜이란 공모양의 기관에 붙는다. 그런 후 mRNA의 암호에 따라 아미노산을 운반하는 tRNA가 해당 아미노산을 가지고 mRNA에 붙는다. 처음에는 작은 리보솜, 다음에는 큰 리보솜이 붙어 다음 아미노산을 받아들일 준비를 마친다. 다음은 합성의 진행으로 두 아미노산의 펩티드 결합이 효소에 의해 이루어지고 제일 먼저 아미노산을 전달한 tRNA가 리보솜을 떠난다. 이런 과정을 되풀이하다가 반응을 중지시키는 mRNA의 암호에 따라 리보솜에서 만들어진 폴리펩티드가 떨어져 나오게 된다. 이 펩티드는 몇 단계의 조정과정을 거쳐 가장 안전한 입체구조를 형성하게 된다.

  단백질은 물이 있는 생체 내에서 일정한 모양을 유지하는 데 가장 적은 에너지만 들도록 만들어지므로 대단히 복잡한 3차원 구조를 가진다. 인간 유전체의 염기서열 연구 이후에는 유전자가 어떤 단백질을 만들어 내는지를 보는 유전자발현정보, 그리고 단백질 입체 구조나 화학변화에서 기능의 차이를 보이는 단백질체학 분야(proteomics)의 연구가 활발해질 것이다.